Актуальность диагностики и коррекции кишечных и внекишечных расстройств у детей, патогенетически связанных с дисбактериозом желудочно-кишечного тракта, в настоящее время очевидно. Клинические проявления кишечных расстройств у детей не всегда коррелируют с результатами микробных карт при бактериологическом анализе фекалий на дисбактериоз кишечника. Применяемый в практике количественный бактериологический метод на дисбактериоз кишечника не дает полного представления о содержании различных представителей облигатно-анаэробной микрофлоры, играющих значимую роль в колонизационной резистентности (КР) кишечника [1].
В последнее время появились новые способы экспресс-диагностики патологии кишечника, основанные на определении протеолитической активности содержимого дистальных отделов кишечника. При кишечной патологии у детей, связанной с дисбиотическими нарушениями, выявляется более высокая протеолитическая активность ферментов в копрофильтратах, чем в норме [5,7]. Оценка протеолитической агрессии микробных ферментов кишечника представляется весьма важной при кишечных расстройствах у детей в качестве скрининговой диагностики дисбактериоза.
Многие представители анаэробной и аэробной микрофлоры кишечника, в том числе наиболее важная группа условнопатогенных микроорганизмов, способны секретировать внеклеточные протеазы, расщепляющие секреторные иммуноглобулины [2,7,8]. В предложенных методах скрининговой диагностики дисбактериозов определяют в основном казеинолитическую активность протеаз копрофильтратов, которая неполно характеризует Ig-протеазный потенциал бактерий толстой кишки.
Целью настоящего исследования является оценка диагностической значимости определения иммуноглобулин расщепляющей активности копрофильтратов детей при кишечных расстройствах, протекающих на фоне дисбактериоза кишечника.
Материалы и методы.
Обследовано 56 детей с выраженными симптомами кишечных расстройств, из них 37 человек дети первого года жизни, 19 детей старше года. Контрольную группу составили 25 клинически здоровых детей с эубиозом толстого кишечника. Диагностика кишечных расстройств и дисбактериоза основывалась на результатах объективного обследования, анамнестических данных и бактериологических исследований.
Протеолитическую активность ферментов копрофильтратов и изолятов условнопатогенных бактерий (УПБ), выделенных из испражнений детей, определяли с помощью оригинального метода, основанного на иммуноферментном анализе. В качестве субстрата для ферментативной реакции в работе использован фармакопейный препарат нормального иммуноглобулина человека, поскольку расщепление иммуноглобулина ферментами копрофильтратов более точно отражает IgG расщепляющий потенциал содержимого дистальных отделов кишечника. Реакцию протеолиза проводили в трис-HCl буфере (рН=7,85) в течение 1 часа при 37ºC, в полистироловом планшете.
Для определения активности протеаз по классам в реакционную смесь вносили растворы необратимых ингибиторов. Далее методом ИФА определяли концентрацию нерасщепленных антител в реакционной смеси [4]. Активность протеаз общую и по классам (сериновые, металлозависимые, тиоловые) в копрофильтратах выражали в количестве иммуноглобулина, расщепленного за 1 час при 37ºС, в пересчете на 1 г фекалий. Активность Ig-протеаз изолятов УПБ выражали в количестве антител, расщепленных за 1 час инкубации при 37ºС, в пересчете на 1 млрд. микробных тел.
Результаты
У 92% обследованных детей с симптомами кишечных расстройств бактериологическим методом был диагностирован дисбактериоз кишечника. У детей контрольной группы дисбактериоз кишечника не выявлен. Детей с дисфункцией кишечника мы разделили на 4 группы.
Первую группу составили дети, имевшие сниженные количества бифидумбактерий или лактобактерий (n=14).
Вторую группу - дети с увеличенным содержанием в кишечнике Escherichia coli с атипичными свойствами (n=16).
Третья группа включала детей, у которых выявляли в высоких концентрациях (107 -108 КОЕ/мл) ассоциации условнопатогенных микроорганизмов (n=16).
У детей этой группы выявлены следующие типы микробных ассоциаций: Enterobacter agglomerans + Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes + Staphylococcus epidermidis, Enterobacter agglomerans + Enterococcus spp., Citrobacter freundii + Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae + Proteus spp. + Candida spp., Proteus vulgaris + Candida spp., Proteus vulgaris + Staphylococcus spp., Enterococcus spp. + Staphylococcus spp. Четвертая группа - дети с массивным ростом бактерий рода Proteus (n=10).
Симптомы кишечных расстройств у больных детей были следующими: болевой абдоминальный синдромом (боли в около пупочной области), жидкий или водянистый стул с патологическими примесями (слизь, зелень), признаки лактазной недостаточности, запоры. Внекишечные проявления у детей, имеющих дисфункцию кишечника, в основном протекали с поражением кожи (опрелости, шелушение кожи, экзема).
У детей 2-й, 3-й, 4-й групп, среди симптомов кишечной дисфункции преобладали симптомы, характерные для воспалительного поражения сигмовидной и прямой кишки. Кишечная дисфункция в виде запоров, наиболее часто выявлялась у детей с высокой концентрацией атипичных вариантов эшерихий, или представителей рода Proteus. Сравнительные данные по активности Ig-протеаз в копрофильтратах больных и здоровых детей представлены в табл. 1.
При анализе анамнестических данных у больных детей выявлены такие факторы риска патологии кишечника, как частое применение антибиотиков (в 1-й группе в 57% случаев дети или их матери лечились антибиотиками широкого спектра действия, а в 4-й группе в 50% случаев) и раннее искусственное вскармливание. Из внекишечных проявлений у детей наибольшая частота кожных поражений выявлена в группе детей с дефицитом бифидо- и лактофлоры (1-я группа) и с высоким содержанием ассоциаций УПБ (Enterobacter spp., Proteus spp., K.pneumoniae, Staphylococcus spp.). У детей с экземой выявлен дефицит лакто - и бифидофлоры. При непереносимости грудного молока (лактазная недостаточность) у детей выявлен дефицит бифидо-и лактофлоры и массивный рост микробов рода Proteus.
Средние значения Ig-протеазной активности Escherichia coli, Staphylococcus aureus и представителей родов Proteus , Klebsiella, Enterobacter , Enterococcus, и доля протеазоположительных культур представлены в табл. 2.
При анализе Ig-расщепляющей активности копрофильтратов у детей c бактериологически подтвержденным дисбактериозом кишечника выявлены следующие особенности. В 100% проб копрофильтратов регистрировали активность сериновых и тиоловых Ig-протеаз. Средние показатели общей Ig-протеазной активности копрофильтратов у детей с кишечной дисфункцией на фоне дисбактериоза достоверно превышали аналогичные показатели у детей контрольной группы.
Закономерным было преобладание активности тиоловых протеаз, по сравнению с контрольной группой. Достоверно выше были средние значения общей протеолитической активности копрофильтратов у детей, колонизированных протеем (4-я группа), по сравнению с пациентами 1-й, 2-й и 3-й групп.
При оценке Ig-протеазного потенциала бактериальных изолятов кишечника детей с дисбактериозом установлено, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладали изоляты K. pneumoniae, P. vulgaris и E. coli, продуцирующие α-гемолизин. Представители кокковой флоры кишечника - коагулазоположительные, гемолитически активные изоляты S. aureus и Enterococcus fecalis в 100% случаев проявляли протеазную активность, однако их Ig-протеиназный потенциал был в 2 раза ниже, чем у представителей семейства Enterobacteriaceae.
Обсуждение
Для многих представителей микрофлоры, колонизирующих слизистые открытых полостей организма человека, характерна способность секретировать протеолитические ферменты, расщепляющие иммуноглобулины [2, 8]. Протеазы, образуемые микрофлорой слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, обладают различной субстратной специфичностью.
При нарушении нормальной микрофлоры кишечника нередко наблюдается селекция клонов УПБ, которые обладают ферментами, ассоциированными с их патогенным потенциалом [6]. В последние годы особое внимание исследователей привлекают ферменты, обладающие функцией Ig-протеаз, которые способны деградировать секреторные и плазменные иммуноглобулины, компоненты комплемента, белки межклеточного матрикса, воздействующие на эндотелий сосудов, активирующие компоненты свертывающей системы крови и фибринолиза.
По-видимому, Ig-протеазы способны запускать и поддерживать воспалительные реакции в слизистой кишечника, снижать уровень специфической и неспецифической резистентности слизистых, приводя в конечном итоге к снижению колонизационной резистентности кишечника.
Многие из изученных микробных протеаз, входящие в состав "экзотоксиновых комплексов", продуцируются только протеазоположительными штаммами микроорганизмов, способными вызвать развитие инфекционного процесса. При комплексном воздействии ферментов патогенности, выделяемых протеазоположительными микроорганизмами кишечника, особенно в сочетании с энтеротоксинпродуцирующей активностью бактерий, заселяющих кишечник, создает условия для возникновения и поддержания воспалительного процесса и развития эндогенной инфекции.
Результаты наших исследований показали, что метод определения Ig-протеазной активности копрофильтратов может быть использован в скрининговой диагностике дисбактериоза кишечника, а также и для контроля эффективности проводимой терапии.
зарегистрируйтесь или войдите чтобы посмотреть ссылку
Добавлено: 20 Май 2013, 09:18:47
Там есть табличка
Автор
Тема: Дисбактериоз, кишечная микрофлора: миф или реальность? (Прочитано 226363 раз)